一种基于Droplet microfluidics的ELISA方法。
Introduction
蛋白质是一种重要的生物标记物，很多蛋白质在生物样本中含量很低，因此需要超灵敏的蛋白检测技术。数字酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）比传统ELISA灵敏度提高了1000倍，但是仍然在很多临床应用中有失灵敏。因此需要开发更灵敏的方法。
在使用单分子阵列（Simoa）的数字ELISA中，使用了远超于靶分子的抗体包被的小珠，因此大多数小珠不会结合任何靶分子。单个蛋白质分子被捕获在小珠上。然后用酶标记蛋白质，然后将小珠分离到飞升大小的孔中，使每个孔只能容纳一个小珠。用油密封阵列后，含有酶标记免疫复合物的孔会产生局部高浓度的荧光产物，从而可以通过对活性孔进行计数来检测单分子。为了确保最大的灵敏度，有必要分析许多小珠，然后分析阳性事件。通常使用外力来促进小珠装入孔中。在Simoa HD-1分析仪中，小珠是通过重力在孔内隔离的。然而，只有约5％的小珠被分离，导致灵敏度下降。可以通过施加磁力来提高顺磁性小珠的装载效率，也有人则使用了电场并显示了珠粒装载量的改善。但是，对免疫复合物形成和测定灵敏度提高的影响尚未得到广泛研究，可以提高珠粒装载效率且灵敏度提高的简单方法仍然需要开发。
油包水液滴的优点如下：
- 能以最小的小珠损失捕获高百分比的小珠进行分析，提高灵敏度。
- 液滴产生装置简单，不需要昂贵而复杂的精细结构。
- 能用一个简单的光学设置对液滴成像。
- 液滴产生很快，在几分钟内能轻易地产生数百万液滴。
他们的液滴数字ELISA（ddELISA）方法灵敏度相比于Simoa提高了25倍，达阿摩尔级（aM或10-18M）。
Figure 1. Single molecule protein detection using ddELISA
- （A）将100,000个抗体包被的顺磁珠添加到包含靶蛋白分子的样品中。然后加入生物素化的检测抗体和SβG，并与靶蛋白分子结合，形成酶标记的免疫复合物。根据泊松统计，大多数磁珠将具有零个免疫复合物，而一小部分将具有一个免疫复合物。
- （B）然后将小珠重新溶解在2μL的酶底物中。
- （C）然后将包含小珠和底物的2μL混合物划分到皮升级液滴中。
- （D）将液滴装载到腔室中，形成液滴阵列。
- （E）在三个通道中获得图像，以识别“含靶蛋白”的液滴，小珠和液滴。
双抗体夹心法，是将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，然后把多余抗原洗除；加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，使一单位的抗原同时结合两单位的抗体形成“夹心”；最后加入该酶的底物，根据产生的有色酶解产物颜色的深浅来判断待测抗原的含量。
作者认为的优势：
- 小珠的数量比Simoa的500,000减少到了100,000，从而有更高的fon ，信号也更高。此外，更方便即时应用。传统的微孔阵列则很难如此减少，因为对可分析小珠的数量有要求。
- 数字读数系统，小珠被包裹于皮升级的液滴中而不是飞升级的小孔。
- 使用的FDG底物比Simoa的RGP在液滴里更稳定。
Figure 2. Theoretical calculations
- （A）指定浓度下，小珠数目增多，每珠平均酶（AEB） 减少。
- （B）指定浓度下，分析的小珠百分比的越高，阳性事件数越高。
- （C）有限检测极限（LOD）随分析小珠分数而降低，即敏感度越高。此外，离解常数（KD）越低，敏感度越高。
Figure 3. ddELISA device design
- （A）1为油和表面活性剂入口，2为小珠和底物混合物入口，3为液珠出口。通道连接处宽度为9 μm，连接处最小特征为5 μm。整个装置尺寸为4.5 mm × 7 mm。
- （B）蓝框显示了阻塞柱，用于防止液滴（直径14 μm）逸出。两个立柱6之间的距离为7 μm。绿框显示了132个子室之一。柱4直径为60 μm，柱5之间为20 μm。整个腔室的尺寸为16 mm × 24 mm。
表面活性剂起阻止液滴之间融合的作用。
Figure 4. Calibration curves
- （A）IFNγ和IL-2的ddELISA校准曲线。
- （B）IFNγ和IL-2的Simoa校准曲线。
- （C）两种方法IFNγ和IL-2相对于背景的信号强度比较，底部为局部放大。可见ddELISA有更好的信号增加。
Figure 5. Endogenous protein measurements in serum
分别用两种方法测试三个样本每Marker，Pearson相关系数为0.987，说明这两种方法非常一致。
Figure 6. ORF1 assay and serum levels
- （A）ORF1的ddELISA校准曲线。
- （B）ORF1的Simoa校准曲线。
- （C）两种方法ORF1相对于背景的信号强度比较，底部为局部放大。可见ddELISA在低浓度下有更好的信号增加，然而高浓度下Simoa表现更好，可能是小珠数目更多。
- （D）用Simoa和ddELISA测定癌症和健康血清中ORF1的AEB值。
- （E）健康样本中，ddELISA测出2项，Simoa测出0项；癌症样本中，ddELISA测出5项，Simoa测出2项。相同样本被标记为一个颜色。
Conclusion
- 减少了对液珠阵列的成像时间，并且可以使用广域荧光成像方法。
- 减少了检测荧光信号的时间。因为ddELISA容量是皮升级，而Simoa是飞升级而使用于酶-底物反应产生荧光产物的时间也相应增加。
Other Information
密度梯度离心
本试验用的试剂为Optiprep。
亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在离心力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
Reference
Cohen L, Cui N, Cai Y, et al. Single Molecule Protein Detection with Attomolar Sensitivity Using Droplet Digital Enzyme-Linked Immunosorbent Assay[J]. ACS Nano, American Chemical Society, 2020, 14(8): 9491–9501.
